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第1章 绪论1

1.1 基因工程的诞生2

1.1.1 理论上的三大发现2

1.1.2 技术上的三大发明4

1.2 基因工程的定义及主要研究内容6

1.2.1 基因工程的定义6

1.2.2 基因工程的主要研究内容8

1.3 基因工程的发展概况9

1.4 基因工程的安全性问题12

第2章 基因工程的基本技术14

2.1 核酸分子的提取14

2.1.1 总DNA的提取15

2.1.2 RNA的提取16

2.1.3 质粒DNA的提取18

2.2 电泳技术21

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳22

2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳25

2.2.3 脉冲电泳凝胶电泳26

2.3 基因的分子克隆27

2.3.1 基因克隆所需的核酸酶27

2.3.1.1 核酸内切限制酶29

2.3.1.2 DNA连接酶32

2.3.1.3 DNA聚合酶33

2.3.1.4 DNA分子克隆中所使用的其他工具酶34

2.3.2　基因克隆的主要载体类型35

2.3.2.1 质粒载体35

2.3.2.2 噬菌体载体39

2.3.2.3 柯斯质粒载体44

2.3.2.4 单链DNA噬菌体载体45

2.3.2.5 噬菌粒载体48

2.3.2.6 真核细胞的克隆载体50

2.3.3 DNA的体外重组51

2.3.3.1 外源DNA片断同载体分子的重组51

2.3.3.2 重组体分子导入受体细胞的途径54

2.4 重组体的筛选与鉴定56

2.4.1 遗传检测法56

2.4.1.1 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法56

2.4.1.2 根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法57

2.4.2 物理检测法58

2.4.2.1凝胶电泳检测法58

2.4.2.2 R-环检测法58

2.4.3 菌落或噬菌斑杂交筛选法59

2.4.4 免疫化学检测法60

2.4.5 DNA-蛋白质筛选法60

2.4.6 转译筛选法61

2.4.6.1 杂交抑制的转译61

2.4.6.2 杂交选择的转译61

第3章 目的基因的分离63

3.1 基本概念64

3.1.1 cDNA文库64

3.1.1.1 cDNA文库构建的基本步骤64

3.1.1.2 cDNA表达文库65

3.1.2 基因组文库66

3.1.2.1 λ噬菌体载体构建基因组文库的步骤67

3.1.2.2 柯斯质粒构建基因组文库及其优缺点68

3.1.3 PCR技术69

3.2 根据特异蛋白分离目的基因71

3.3 根据奇异mRNA分离目的基因72

3.3.1 差别杂交72

3.3.1.1 差别杂交的原理72

3.3.1.2 差别杂交技术的局限性73

3.3.2 mRNA减法杂交技术74

3.3.2.1 减法杂交的原理74

3.3.2.2 减法杂交技术的优缺点76

3.3.3 mRNA差别显示技术76

3.3.3.1 mRNA差别显示技术的一般原理77

3.3.3.2 mRNA差别显示技术的优越性及应用78

3.3.3.3 mRNA差别显示技术的缺陷79

3.3.4 cDNA代表性差别分析技术80

3.3.4.1 cDNA代表性差别分析技术原理80

3.3.4.2 代表性差别分析技术的操作流程80

3.3.4.3 代表性差别分析技术的优缺点82

3.3.5 抑制性减法杂交技术82

3.3.5.1 抑制性减法杂交技术的原理82

3.3.5.2 抑制性减法杂交技术的操作流程84

3.3.5.3 抑制性减法杂交技术的优缺点85

3.4 利用DNA插入法分离目的基因86

3.4.1 转位子标签法86

3.4.1.1 转位子标签法的一般概念86

3.4.1.2 转位子标签法分离基因的程序88

3.4.1.3 转位子标签法的局限性90

3.4.2 T-DNA标签法90

3.5 染色体步行法分离目的基因91

3.5.1 染色体步行法的基本原理91

3.5.2 染色体步行法的基本操作步骤91

3.6 表达序列标签法分离目的基因92

3.6.1 表达序列标签法的定义92

3.6.2 表达序列标签法分离基因的基本步骤92

3.6.3 表达序列标签法的应用92

3.7 基因表达系列分析法93

3.7.1 基因表达系列分析法的原理93

3.7.2 基因表达系列分析法的具体过程94

3.8 酵母双杂合系统94

3.8.1 酵母双杂合系统的原理及应用95

3.8.2 酵母双杂合系统的实验程序95

3.8.3 酵母双杂合系统分离目的的基因的优缺点97

3.9 目的基因的分离方法总结97

第4章 克隆基因的表达体系99

4.1 表达体系与表达产物99

4.2 大肠杆菌表达体系100

4.2.1 原核生物基因表达的特点100

4.2.2 外源基因在原核细胞中表达的调控元件100

4.2.2.1 启动子100

4.2.2.2 SD序列101

4.2.2.3 终止子102

4.2.3 几种类型的原核表达载体102

4.3 提高外源基因表达水平的措施103

4.4 植物表达体系与植物基因工程103

4.4.1 植物基因工程的目的基因104

4.4.2 植物基因工程的载体--Ti质粒106

4.4.2.1 Ti质粒的遗传特性、结构及功能106

4.4.2.2 T-DNA的结构与功能107

4.4.2.3 Vir区操纵子的基因结构与功能108

4.4.2.4 植物基因转化的载体系统108

4.4.3 植物组织培养与基因转化的受体系统109

4.4.4 植物基因工程中常用的报告基因110

4.4.5 植物基因转化方法112

4.4.5.1 共培养法113

4.4.5.2 病毒介导的基因转移116

4.4.5.3 基因枪法介导的基因转化119

4.4.5.4 PEG诱导的基因转化122

4.4.5.5 脂质体介导的基因转化123

4.4.5.6 电激法介导的基因转化124

4.4.5.7 超声波介导的基因转化125

4.4.5.8 显微注射介导的基因转化125

4.4.5.9 激光微束介导的基因转化126

4.4.5.10 种质系统介导的基因转化126

4.4.6 外源基因在转基因植物中的表达调控127

4.4.6.1 高等植物基因表达调控特点128

4.4.6.2 转化外源基因的瞬时表达与稳定表达129

4.4.6.3 DNA序列对转化外源基因的表达调控130

4.4.6.4 DNA甲基化对转化外源基因表达的调控作用131

4.4.7 提高转化外源基因表达的策略132

4.4.8 植物基因工程中存在的问题及新策略133

4.5 动物表达体系与动物基因工程135

4.5.1 外源基因导入动物细胞的载体135

4.5.2 动物基因转移中的遗传选择标记136

4.5.3 外源DNA导入动物细胞的方法137

4.5.4 动物的转基因技术及建立途径137

4.5.5 转基因动物研究中存在的主要问题140

第5章 转基因技术的应用141

5.1 转基因技术在医学上的应用141

5.1.1 基因治疗142

5.1.1.1 基因治疗的原理142

5.1.1.2 基因治疗的应用142

5.1.1.3 基因治疗中所面临的几个问题143

5.1.2 转基因技术与药用蛋白的生产143

5.1.2.1 疫苗、抗原、抗体144

5.1.2.2 药用酶类145

5.1.2.3 生长因子145

5.1.2.4 其他药用化合物146

5.2 转基因技术在农业中的应用147

5.2.1 转基因农作物147

5.2.1.1 抗虫农作物147

5.2.1.2 抗病毒农作物148

5.2.1.3 抗除草剂农作物149

5.2.1.4 抗胁迫农作物149

5.2.1.5 转基因技术与细胞质雄性不育149

5.2.2 转基因植物与日常生活150

5.2.2.1 服装150

5.2.2.2 园艺植物151

5.2.2.3 食品和饮料151

5.2.3 转基因动物153

5.3 转基因技术在环境保护中 的应用155

5.4 转基因技术在工业中的应用155

5.4.1 生物能源和燃料155

5.4.2 木质素和造纸156

5.4.3 塑料156

主要参考书目157